AO_863_Anti_poliferativo_cancer

Efecto anti-proliferativo en líneas celulares de cáncer de mama y cérvico-uterino causado por nanotubos de carbono múltipared - lectina de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet

Jazmín Aguilar-Vázquez1, María del Socorro Pina-Canseco2, Yadira Gochi-Ponce3, Alma Dolores Pérez-Santiago1*

1Unidad de Bioquímica e Inmunología, División de Estudios de Pogrados e Investigación, Tecnológico Nacional de México, Instituto Tecnológico de Oaxaca, Oaxaca de Juárez Oaxaca, México; 2Laboratorio de Biología Celular en Cáncer e Inflamación, Centro de Investigación, Facultad de Medicina y Cirugía, UNAM-UABJO, Oaxaca de Juárez Oaxaca, México; 3Tecnológico Nacional de México, Instituto Tecnológico de Tijuana, Tijuana Baja California, México

Historial del artículo

Recibido: 11 sep 2020

Aceptado: 28 feb 2021

Disponible en línea: 1 may 2021

 

Palabras clave

Lectina de Phaseolus lunatus, nanotubos de carbono, cáncer de mama, cáncer cérvico uterino, efecto citotóxico.

Keywords

Lectin of Phaseolus lunatus, carbon nanotubes, breast cancer, uterine cervical cancer, cytotoxic effect.

Copyright © 2021 por autores y Revista Biomédica.

Este trabajo está licenciado bajo las atribuciones de la Creative Commons (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

 

*Autor para correspondencia: Alma Dolores Pérez-Santiago, Unidad de Bioquímica e Inmunología, División de Estudios de Posgrados e Investigación, Tecnológico Nacional de México, Instituto Tecnológico de Oaxaca/ Oaxaca de Juárez Oaxaca, México, 68030. Tel:+52951 229 97 30

Email: aperez_santiago@hotmail.com

https://revistabiomedica.mx.

abstract

  1.  

Anti-proliferative effect in breast and cervical-uterine cancer cell lines, caused by multi-walled carbon nanotubes - lectin of Phaseolus lunatus var. silvester Baudet

Introduction. Carbon nanotubes have been conjugated with a wide range of molecules for use in medicine due to the properties they have, such as size, chemical and mechanical properties, and they can be targeted at specific sites.

Objective. To evaluate the cytotoxic effect of the multiple-walled carbon nanotube conjugate with lectin de Phaseolus lunatus (NTCPM-lPl) in four carcinoma cell lines (MDA MB-231, MCF-7, ViBo and HeLa).

Methods. Multiple-walled carbon nanotube (NTCPM) were purified in a mixture of concentrated acids, 1: 3 [HNO3 (70%) / H2SO4 (95-98%)] and sonicated for 4 h, the pH was adjusted to 7 and incubated with lectin of Phaseolus lunatus var. silvester (lPl) for 4 h under constant stirring at 4° C. The cytotoxic activity of IPI and the NTCPM-IPI conjugate was measured by MTT and crystal violet tests at 24, 48 and 72 h, in two carcinoma cell lines.

Results. Synchronized ViBo, MDA MB-231 and MCF-7 cells showed a reduction of 51, 53 and 47% respectively with the NTCPM-lPl conjugate, while HeLa showed a 55% reduction with lPl alone.

Conclusions. Cytotoxic activity is potentiated using the NTCPM-lPl conjugate in synchronized ViBo, MDA MB-231 and MCF-7 cells; however, for HeLa cells the effect is produced by lPl alone, so conjugation is unnecessary.

RESUMEN

Introducción. Los nanotubos de carbono se han conjugado con una amplia gama de moléculas para el uso en medicina debido a las propiedades que presentan, como tamaño, propiedades químicas y mecánicas, además que pueden dirigirse a sitios específicos.

Objetivo. Evaluar el efecto citotóxico que presenta el conjugado nanotubo de carbono de pared múltiple con lectina de Phaseolus lunatus (NTCPM-lPl) sobre cuatro líneas celulares de carcinoma (MDA MB-231, MCF-7, ViBo y HeLa).

Métodos. Los nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) se purificaron en una mezcla de ácidos concentrados, 1: 3 [HNO3 (70 %) / H2SO4 (95-98 %)] y se sometieron a sonicación durante 4 h, el pH se ajustó a 7 y se incubó con lectina de Phaseolus lunatus var. silvester (lPl) durante 4 h en agitación constante a 4ºC. La actividad citotóxica de lPl y el conjugado NTCPM-lPl se midió por pruebas de MTT y cristal violeta a las 24, 48 y 72 h, en dos líneas celulares de carcinoma.

Resultados. Las células ViBo, MDA MB-231 y MCF-7 sincronizadas mostraron una reducción del 51, 53 y 47 % respectivamente con el conjugado NTCPM-lPl, mientras que HeLa mostró un 55 % con lPl sola.

Conclusiones. La actividad citotóxica se potencializa utilizando el conjugado NTCPM-lPl en células ViBo, MDA MB-231 y MCF-7 sincronizadas; sin embargo, para células HeLa el efecto es producido por la lPl sola por lo que es innecesaria la conjugación.

INTRODUCCIÓN

Las lectinas son proteínas o glicoproteínas de origen no inmune que reconocen de manera específica carbohidratos de la superficie celular o en suspensión, aglutinan células y precipitan glicoconjugados, algunas poseen por los menos dos sitios de reconocimiento a carbohidrato, de ahí su capacidad para aglutinar células (1). Algunas lectinas comparten la propiedad de participar en procesos biológicos y presentan la capacidad de interaccionar con el sistema inmune (2). Las lectinas de leguminosas han sido estudiadas a partir de extractos crudos y purificados, ya que pueden presentar diversas propiedades biológicas como: antiproliferativas (3), citotóxicas (4), mitóticas (5), inmunomoduladoras (6), antifúngicas (7) antivirales (8), entre otros.

Las semillas de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet, también conocidas en la región de la Costa de Oaxaca como frijol “rojo rayado”, es un alimento comúnmente consumido que proporciona beneficios nutricionales debido a su alto contenido de fibra y bajo contenido de grasa, contiene aminoácidos esenciales principalmente ácido aspártico, serina y leucina (9). Se estima que la lectina purificada a partir del frijol “rojo rayado” tiene un contenido de 4.5 % de carbohidratos, como manosa, glucosa, fucosa, arabinosa y xilosa, lo que indica que se trata de una glicoproteína, asimismo es una de las muchas lectinas que muestran afinidad por 2-acetamido-2-desoxi-D-galactosa (o N-acetil-D-galactosamina) y cuentan con alta especificidad por eritrocitos humanos tipo A (10).

Por otra parte, los nanotubos de carbono (NTC) son alótropos de carbono, compuestos por una o varias capas de grafeno enrolladas, las cuales están formadas por múltiples anillos de átomos de carbono perfectamente estructurados. Su tamaño varía desde unos nanómetros de diámetros hasta varios milímetros de largo. Los enlaces químicos que unen a los átomos de carbono son uniones sp2 y sp3 que les confiriere fuerza y longitud ilimitada; las láminas de grafeno se atraen entre sí mediante fuerzas de Van der Waals (11). Sus propiedades estructurales, mecánicas y electrónicas son impresionantes debido a su pequeño tamaño y masa (12), además de su gran área superficial que permite adsorber o conjugar con una amplia variedad de moléculas terapéuticas como: fármacos, proteínas, anticuerpos, ADN, enzimas, etc. (13,14). En el presente estudio se evaluó el efecto citotóxico de un conjugado preparado a base de nanotubos de carbono de pared múltiple con lectina de Phaseolus lunatus var. silvester (NTCPM-lPl) sobre cuatro líneas celulares de carcinoma (MDA-MB 231, MCF-7, HeLa y ViBo).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las semillas de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet o frijol rojo rayado se obtuvieron en la comunidad de Jamiltepec, Oaxaca, México, las cuales corresponden al número de catálogo 33373 (15), fueron almacenadas en un lugar fresco dentro de un frasco de vidrio hermético hasta el momento de su análisis; las semillas utilizadas en el análisis no tuvieron ningún tratamiento previo y se usaron completamente secas y maduras. El gel Sephadex G-200 y el azúcar N-Acetil-D-galactosamina fueron adquiridos en Sigma Aldhrich, USA; el medio de crecimiento Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) 1X con L-glutamina fue marca Caisson, USA; el Suero Fetal Bovino (SFB) marca Biowest, USA; la solución de Tripsina–EDTA marca Corning, USA; el agua inyectable marca PiSA, México; los nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) fueron proporcionados por la Dra. Yadira Gochi Ponce del Centro de Investigación de Materiales del Instituto Tecnológico Nacional de México, Campus Tecnológico de Tijuana, México; los NTCPM se obtuvieron por el método de aspersión pirolítica, empleando 0.076 gr de ferroceno, 2 mL de Tolueno con una velocidad de flujo de 0.5 L/min de argón. Las líneas celulares de cáncer cérvico-uterino (CaCu) y mama fueron donación de la Dra. Rebeca López Marure del Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez, Tlalpan, Edo. México: HeLa, proveniente de adenocarcinoma, positiva para VPH 18 (ATCC®CCL-2); ViBo, una línea celular generada en México la cual es negativa para VPH, obtenida de un carcinoma primario de CaCu; MCF-7, proveniente de adenocarcinoma, es una línea luminal epitelial con receptores de estrógeno, progesterona y glucocorticoides (ATCC®HTB-22); y MDA-MB 231, proveniente de adenocarcinoma, derivada de derrame pleural y negativa para ER, PR y E-cadherina y expresa p53 mutado (ATCC®HTB-26); Las muestras de eritrocitos se obtuvieron de donantes sanos provenientes del Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Oaxaca, México.

Aislamiento y purificación de la lectina

Las semillas de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet (200 g) fueron molidas en una licuadora industrial marca laboratory Blender, la harina obtenida fue empleada para extracción de proteínas con buffer de fosfatos salinos (PBS) pH 7.2. Una vez obtenido el extracto se eliminaron proteínas de bajo peso molecular con NH2(SO4)2 al 20 % de saturación. El sobrenadante fue ajustado posteriormente a 60 % de saturación nuevamente con NH2(SO4)2. El precipitado obtenido fue suspendido en PBS pH 7.2 y posteriormente dializado contra agua y equilibrado con PBS pH 7.2 para su purificación por cromatografía de filtración en Sephadex G-200 (2 cm × 45 cm). A las fracciones obtenidas se les midió proteína por la técnica de Bradford (16) y actividad de lectina por hemaglutinación con eritrocitos humanos tipo A al 3 % (17), ésta se observó en un microscopio binocular marca Zeiss Axiolab. Se siguió el procedimiento reportado para extracción y purificación de la lectina de Phaseolus lunatus variedad silvester Baudet.

Construcción del Complejo NTCPM-lectina

Purificación y funcionalización de NTCPM

Se utilizaron 6 mg de NTCPM los cuales se adicionaron a 20 mL de una mezcla de ácidos concentrados [1:3 [HNO3 (70 %)/ H2SO4 (95-98 %)](18), sometiéndolos a sonicación por 4 h a 42 KHz, trascurrido el tiempo reposaron por 24 h a temperatura ambiente, enseguida se ajustó el pH a 7 por centrifugación con agua bidestilada a 3750 rpm, ajustado el pH se cambió el agua destilada por buffer de fosfatos PBS a pH.7.2, posteriormente se tomaron 150 µL de NTCPM y se incubaron con 600 µL de lPl (5 mg mL-1) en agitación constante a 4°C por 18 h, finalmente el complejo formado se lavó con PBS a pH 7.2 a 10 000 rpm por 10 min, para eliminar residuos de lectina no unidos.

Cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer de mama humano (MDA MB-231, MCF-7) y cáncer cervical humano (HeLa y ViBo) fueron cultivadas bajo las mismas condiciones, empleando medio de crecimiento RPMI-1640 con L-glutamina, acondicionándolo con 10 % de suero fetal bovino (SFB) y 1 % de antibiótico / antimicótico. Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmosfera de CO2 al 5 % de humedad relativa.

Sincronización celular

La sincronización celular se llevó a cabo privando a las células de nutrientes, en el ensayo se disminuyó la concentración de SFB del 10 al 3 %, por lo que el crecimiento de las líneas celulares es más lento y hace que las células se encuentren sometidas a estrés, por lo tanto, disminuye la confluencia en los primeros días y entran en una misma fase de crecimiento, por lo que es necesario ampliar el tiempo del cultivo para alcanzar la confluencia deseada.

Actividad antiproliferativa y viabilidad celular en lPl

El efecto antiproliferativo de la lectina de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet sobre líneas celulares de cáncer de mama y cáncer cérvico-uterino, se evaluó mediante pruebas colorimétricas utilizando sal de tetrazolio (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, MTT) (19), debido a que este ensayo mide la proliferación celular reduciendo metabólicamente la sal por la acción de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa. El compuesto resultante (azul de formazán) puede solubilizarse y cuantificarse espectrofotométricamente. Las células se cultivaron en placas de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos para cultivos celulares. Se añadieron 100 μL por pocillo a una confluencia de 5 x 103 células en medio RPMI 1640 con L-glutamina y 10% SFB, después de 24 h se cambió el medio de crecimiento colocando 95 μL de medio nuevo y 5 μL de lPl, para tener una concentración final de la lectina de 0.04, 0.12, 0.2, 0.28, 0.42, 0.44, 0.52, 0.6, 0.7, 2.1, 3.5, 4.9, 6.3, 7.7, 9.1, 10.5 µg mL-1, posteriormente se incubó a tres tiempos, 24, 48 y 72 h , en una atmósfera al 5% de CO2 a 37 ºC.

Transcurrido el tiempo de cada tratamiento, se agregaron 20 μL de MTT (5 µg mL-1) y se incubó por 4 h en oscuridad, posteriormente se decantó el medio y agregaron 50 μL de isopropanol acidificado, después se leyó a una densidad óptica (OD) de 570 nm en un lector de microplacas Multiskan FC.

La viabilidad celular se midió mediante ensayos de cristal violeta (CV) (20), pasado el tiempo de incubación se decantó el medio de crecimiento y añadieron 50 μL de glutaraldehído al 1,1% por 10 minutos para fijar las células, posteriormente se lavaron las células con agua corriente y escurrieron para teñir con 50 μL de violeta cristal por 20 min, a continuación, se lavaron con agua corriente y se colocaron 50 μL de ácido acético al 10% y se leyeron a una OD de 595 nm en un lector de microplacas Multiskan-FC.

Actividad antiproliferativa y viabilidad celular en conjugado NTCPM-lPl

El efecto antiproliferativo del conjugado NTCPM-lPl en líneas celulares de cáncer de mama y cáncer cérvico-uterino, se evaluó mediante pruebas colorimétricas de MTT y CV. Las células fueron cultivadas en placas de 96 pocillos para cultivos celulares, añadiendo 100 μL de células por pocillo a una confluencia de 5 x 103 células durante 24 h, trascurrido el tiempo se cambió el medio de crecimiento colocando 95 μL de medio nuevo y 5 μL del conjugado NTCPM-lPl, utilizando como controles a los NTCPM y lPl solos, en los mismos tiempos establecidos 24,48 y 72 h.

Análisis estadístico.

Todos los datos se expresan en porcentaje (%) de absorbancia media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes (significa ± DS, n = 3), utilizando controles de disolvente y medio de crecimiento como referencia. El análisis estadístico se realizó con la prueba t Student utilizando el software Prisma (Graph Pad Prism 5), donde los valores fueron considerados estadísticamente significativos cuando p<0.05 (*) en comparación con el control de células en crecimiento normal.

RESULTADOS

Purificación de lectina de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet

Se recuperaron 30 mL de una solución de lectina con 81,920 unidades hemaglutinantes (UHa mL-1) y 12.5 mg mL-1 de proteína. La lectina obtenida a partir de Phaseolus lunatus mostró fuerte actividad hemaglutinante hacia eritrocitos humanos tipo A, como se muestra en la Figura 1.

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Figura 1. Actividad de lectina. A) Prueba de hemaglutinación: F1. Control negativo (PBS + eritrocitos humanos tipo A al 3 %). F2. Control negativo (NTCPM + eritrocitos humanos tipo A al 3 %). F3. Lectina de Phaseolus lunatus + eritrocitos humanos tipo A al 3 %. F4 y F5. Conjugado NTCPM-lectina + eritrocitos humanos tipo A al 3 %. Se observó que la lectina Phaseolus lunatus se mantiene activa después de la unión con los NTCPM; B) Micrografía de F2, a 40x, no se observó interacción; C) Micrografía de F3, vista a 40x., mostró afinidad hacia eritrocitos humanos tipo A y se observa en forma de aglutinación; D) Micrografía de F4, vista a 40x, mostró afinidad hacia los eritrocitos lo cual indicaría que la unión con los NTCPM fue exitosa.

Evaluación de la actividad citotóxica

Basados en los ensayos de MTT usando células de cáncer cérvico uterino y cáncer de mama tratadas con la lectina de Phaseolus lunatus var. silvester, se observó una reducción de la viabilidad celular en comparación con las células no tratadas con la lectina.

El cultivo de ViBo de 24 h de incubación con 0.6 µg mL-1 de la lectina presentó el 45 % de inhibición de la proliferación celular (Figura 2A) y una viabilidad celular del 63%; mientras que el cultivo de MDA MB-231 incubado con 0.44 µg mL-1 de la lectina, a las 48 h presentó un 43 % de inhibición de la proliferación celular y viabilidad celular del 58 % (Figura 2B). Para el caso de células HeLa y MCF-7 incubadas con la lectina no se presentaron diferencias significativas en la proliferación celular y viabilidad, en comparación con el control de células no tratadas. Por su parte, las células HeLa sincronizadas sí presentaron inhibición de la proliferación en un 55 %, con una concentración de 10.5 µg mL-1 de la lectina (Figura 2C), y viabilidad celular del 49 %. En el cultivo de MCF-7 se observó el 42% de la inhibición de la proliferación celular con concentraciones de 10.5 µg mL-1 (Figura 2D), con vialidad celular del 60 %. Ambas líneas presentaron inhibición de la proliferación celular a las 72 h de incubación con lPl.

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Figura 2. Efecto de la IPI, NTCPM y conjugado NTCPM-IPI sobre la proliferación de las líneas celulares neoplásicas ViBo (A), MDA-MB 231(B), HeLa (C) y MCF-7 (D) evaluadas mediante los ensayos de MTT, de forma independiente y por triplicado, como se describe en material y métodos. C.C: Control de células vivas; C. S: Control de disolvente; C. NTCPM: Control de Nanotubos de Carbono de Pared Múltiple; IPI: Lectina de Phaseolus lunatus en concentraciones de 0.44, 0.6 y 10.5 µgmL-1; NTCPM-IPI: Conjugado Nanotubo de Carbono-lectina de Phaseolus lunatus en concentraciones de 0.44, 0.6 y 10.5 µgmL-1.

En cuanto al conjugado NTCPM-lPl, este resultó citotóxico para las dos líneas celulares de cáncer estudiadas, comparadas con los resultados producidos con la lPl sola en los tres tiempos establecidos y las mismas concentraciones de lectina, según la Tabla 1. El conjugado NTCPM-lPl en células ViBo mostró una actividad citotóxica del 51 % (Figura 2A) mientras que la viabilidad celular fue de 39% a las 24 h; para MDA MB-231 el efecto citotóxico fue de un 53 % a las 48 h (Figura 2B) y una viabilidad celular del 49 %.

Para las células sincronizadas HeLa el conjugado NTCPM-lPl mostró una actividad citotóxica del 54 % (Figura 2C), estadísticamente muy similar al expresado por la lectina sola, además la viabilidad celular fue de 66%. En las células MCF-7 se obtuvo un 47% de actividad citotóxica (Figura 2D) y una viabilidad celular del 54 %.

Tabla 1. Efecto citotóxico de la lectina de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet y el conjugado NTCPM-lPl en células ViBo, MDA MB-231, HeLa y MCF-7 evaluados mediante ensayo de MTT.

CONDICIONES

lPl

NTCPM-lPl

Células en crecimiento normal

Dosis-respuesta

Tiempo (h)

Actividad citotóxica (%)

Viabilidad celular (%)

Actividad citotóxica (%)

Viabilidad celular

(%)

ViBo

0.6 µg mL-1

24

45

63

51

39

48

43

67

29

42

72

37

84

9

63

MDA-MB 231

0.44 µg mL-1

24

34

70

53

52

48

43

58

44

63

72

26

60

36

72

Células Sincronizadas

Dosis-respuesta

Tiempo (h)

Actividad citotóxica (%)

Viabilidad celular (%)

Actividad citotóxica (%)

Viabilidad celular

(%)

HeLa

10.5 µg mL-1

24

47

107

38

82

48

40

67

26

71

72

55

55

54

54

MCF-7

10.5 µg mL-1

24

10

100

32

84

48

34

89

46

78

72

42

60

47

66

DISCUSIÓN

La lectina obtenida de Phaseolus lunatus, variedad silvester Baudet por los procedimientos tradicionales de purificación de proteínas (21-23), nos permitió obtener una glicoproteína con una concentración de proteína de 12.5 mg mL-1, alta actividad específica y afinidad hacia eritrocitos humanos tipo A; así como un rendimiento del 13 %. Otras lectinas extraídas de Phaseolus presentan rendimientos similares, la lectina de Phaseolus vulgaris cv. Frijol chino pinto presentó un rendimiento del 8.6 % (24); la lectina de Phaseolus vulgaris cv. Frijol rojo Hokkaido, 17 % (25); la lectina de Phaseolus vulgaris cv. Frijol anasazi: 15,8 % (26) y la lectina de Phaseolus vulgaris cv. Frijol blanco el 53 %, en todos los casos la pigmentación interfiere en el proceso de purificación y no se alcanzan mayores rendimientos (27).

Respecto a los bioensayos de citotoxicidad de la lectina de Phaseolus lunatus sobre líneas celulares de cáncer de mama y cáncer cérvico uterino los resultados demostraron que la lPl puede inhibir la proliferación celular en varias líneas de carcinoma como: MDA MB-231, MCF-7, ViBo y HeLa. El efecto antiproliferativo más rápido se presentó en células ViBo a las 24 h con un IC50 de 0.662 µg mL-1, en comparación con células HeLa donde su efecto antiproliferativo fue del 55 %, mayor al expresado en las células ViBo, con una IC50 9.690 µg mL-1. Este comportamiento puede deberse a que las células HeLa fueron sincronizadas y que son positivas para VPH, por lo tanto, sobreexpresan a la inosina monofosfato deshidrogenasa, el factor de necrosis tumoral (TNF) y la metíltransferasa 1 (28) a diferencia de las células ViBo que son negativas para VPH. Las células MDA MB-231 mostraron mayor sensibilidad (IC50 de 0.425 µg mL-1) al tratamiento con la lectina de Phaseolus lunatus en comparación con la línea celular MCF-7 con una IC50 de 9.228 µg mL-1 a las 72 h. esta diferencia entre las líneas celulares puede deberse a los receptores de membrana que se expresan para cada línea celular, por ejemplo para MDA MB 231, positiva a la expresión del receptor de EGF y al receptor PAR1 de la trombina, a diferencia de MCF-7 la cual es negativa para el receptor PAR1(29), además que fue sincronizada.

Debido a que la transformación maligna se acompaña de profundas alteraciones en los procesos de N y O glicosilación en células sanas (30), los O-glicanos expresados en la superficie de las células cancerosas aparecen como componentes sacáridos de las glicoproteínas, N-acetil-galactosamina (O-GalNAc) unidas a la membrana (antígeno T y Tn) y glucolípidos (Lewis y Lewis X). La sobreexpresión de O y N-glucanos se produce como glucoproteínas y glucolípidos asociados con la membrana, exponiéndolos en la superficie celular (31,32). Por lo tanto, estos receptores de membrana están expuestos y son repetitivos, lo que puede explicar la unión de la lectina a ellos. El antígeno T se expresa en las glucoproteínas de la superficie celular (33), mientras que la lectina de Phaseolus lunatus es específica para GalNac, es decir, pertenece a una de las lectinas vegetales específicas para el antígeno T y Tn. También interactúa con alfa D–Gal, una interacción que depende de la unión a su sitio principal de lectina a través de una red de enlaces de hidrógeno (34).

Tras el reconocimiento por los receptores de la membrana celular del cáncer, las lectinas pueden regular varias vías de señalización responsables de los efectos apoptóticos, antiproliferativos y autofágicos sobre las células cancerosas in vitro e in vivo. Actualmente hay investigaciones sobre los efectos que las lectinas de Phaseolus lunatus producen dentro de los sistemas biológicos. En un estudio de Wu, J. et al., en 2016, se reportó un péptido aislado a partir de semillas comestibles de Phaseolus lunatus billb, denominado “lunatin”, que exhibió actividad hemaglutinante hacia eritrocitos humanos del grupo sanguíneo A, y se mantuvo estable hasta 50 °C, a pH 2-11. Lunatin presentó potente actividad antifúngica y actividad antiproliferativa hacia células de leucemia K562 con una IC50 de 13.7 μM, mientras que las células HeLa y HepG2 solo se vieron débilmente afectadas (36). R. R. e Lacerda, et al., en 2016 estudiaron la actividad antitumoral de una lectina presente en semillas de Phaseolus lunatus L. var. cascavel (PLUN), la lectina exhibió termoestabilidad hasta 80 °C, mostrando actividad a pH 2-11, también expresó actividad antitumoral contra las células derivadas del melanoma a dosis de 100 y 50 µg / mL a las 72 h, reduciendo hasta 83% las células tumorales (36), mientras que Jack Hu Wong y Tzi Bun Ng en 2005, reportaron actividad antiproliferativa en células MCF-7 a partir de un péptido obtenido de Phaseolus Lunatus L, inhibiendo el 90% de la proliferación celular a las 72 h a una concentración de 5,71 µM (37).

La lectina de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet es una lectina estable a temperaturas altas y a un rango amplio de pH (38), y posee actividad hemaglutinante hacia eritrocitos humanos tipo A (39), además es una lectina selectiva ya que es específica para N-acetil-D-galactosamina (40), presenta actividad antiproliferativa y citotóxica en distintas líneas celulares. Los resultados proporcionan evidencia de que esta lectina puede ser una valiosa herramienta para estudios de células cancerosas.

Debido a las propiedades y efectos que produce la lectina de Phaseolus lunatus se utilizó para la elaboración de un nuevo nanomaterial utilizando nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM).

Los NTC tienen la particularidad de ser materiales de muy pequeñas dimensiones con potencial para aplicaciones médicas (41). Por ejemplo, como portadores de droga en el organismo ya que son nanomateriales huecos y mucho más pequeños que las células sanguíneas (42). Además, pueden ser fácilmente modificados con una amplia variedad de moléculas a través de varios procedimientos. Por ejemplo, se pueden incorporar proteínas u otras biomoléculas sobre la estructura de los NTC y con ello aumentar su biocompatibilidad y biodisponibilidad, haciéndolos solubles en agua, altamente estable, dispersos, y con capacidad de carga (43-45), por lo que al ser funcionalizados se mejora la eficacia terapéutica y reduce la toxicidad del NTC.

Por lo tanto los NTCPM empleados en este estudio al ser sometidos a sonicación en reflujo en ácidos concentrados permitieron la generación de grupos funcionales como COOH-, OH- y NH+ , los cuales fueron utilizados para la funcionalización con la lectina de Phaseolus lunatus, este acoplamiento se puede verificar con técnicas de espectroscopia de infrarrojo, Raman, Uv-Vis, y técnicas de microscopia electrónica de barrido y transmisión, entre otras más; de la misma forma se puede verificar midiendo la actividad de lectina con eritrocitos humanos tipo A y observándolos al microscopio (Figura 1).

Debido a que el conjugado NTCPM- lectina es soluble a pH biológico, se mantuvo estable y disperso, y se evaluó sobre líneas celulares de carcinoma, demostrando que el efecto citotóxico de la lectina unida al NTCPM se potencializa en algunas líneas celulares de cáncer de mama y cáncer cérvico uterino. Las pruebas de MTT y CV fueron eficientes para la determinación del efecto citotóxico (46), para la línea celular ViBo (Figura 2A) se presentó un efecto citotóxico del 51 % a las 24 h con el conjugado, mayor al expresado con la lectina sola a las 24 h, el cual fue del 45%, sin embargo, transcurrido el tiempo de incubación con el conjugado la proliferación celular comienza a regenerarse, por lo que se puede decir que se presentó únicamente un arresto del ciclo celular dependiente del tiempo. Para las células HeLa sincronizadas (Figura 2C) no se presentó diferencia significativa del conjugado NTCPM-lPl (54 %) en comparación con la lPl (55 %) a las 72 h, por lo tanto, se puede decir que el efecto citotóxico es producido exclusivamente por la lectina y no por los NTCPM. Para las líneas celulares MDA MB 231 y MCF-7 sincronizadas se observó que el efecto citotóxico de la lectina se potencializa con la unión al NTCPM, para MDA MB-231(Figura 2B) se mostró efecto con la lPl a las 48 h con un 43 %, mientras que con el conjugado NTCPM-lPl su efecto máximo se presentó a las 24 h con un 53 %, para el caso de MCF-7 sincronizadas (Figura 2D) se presentó un efecto del 42 % con la lPl y un 47% con el conjugado NTCPM-lPl.

Seyed Y.M. et al., en 2012 reportaron la funcionalización de NTC de pared simple y su unión a las células cancerosas, la interacción de lectina con células MCF-7 se midió a concentraciones de 12.5 y 25 μg mL-1, utilizando lectina HPA (Aglutinina Helix pomatia) sola y lectina HPA-NTCPS. La unión de la lectina HPA fue comparable al obtenido por lectina HPA-NTCPS, lo que indicó que el proceso de conjugación no afectó la velocidad de unión del epítopo por la lectina, por lo tanto, no potencializó su interacción (47). Xue, Y. en 2011 sugirió que la funcionalización NTCPM con lectinas podría aplicarse potencialmente en estudios biológicos celulares basados en la expresión de glucano en la superficie celular (48), y que los NTCPM en dosis bajas son un prometedor vehículo de administración de fármacos para las terapias dirigidas de células anormales en cáncer de seno (49).

CONCLUSIÓN

Se logró determinar la actividad citotóxica y antiproliferativa de la lectina de Phaseolus lunatus var. silvester Baudet a través de ensayos de viabilidad y proliferación celular utilizando el reactivo de MTT. La actividad citotóxica de la lectina de Phaseolus lunatus sobre líneas celulares de carcinoma ViBo, MDA MB-231 y MCF-7 sincronizadas se potencializa utilizando NTCPM, sin embargo, en células ViBo el efecto que se presenta solo es transitorio, y en células HeLa el efecto es producido exclusivamente por la lectina, por lo que es innecesaria la unión con el NTCPM. Los NTCPM tienen un alto potencial dentro del área biomédica, para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer, pudiéndose utilizar como biomarcadores o sistemas de detección con alta especificidad, sin embargo, se necesita una funcionalización eficiente para el empleo de estos nanomateriales, conjuntamente se requiere de más estudios para determinar sus posibles mecanismos de acción dentro de las células y hacer que esta afirmación sea verídica en un futuro.

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