Evidencia de Leptospira spp. en musarañas Cryptotis mayensis. Nuevo hospedero en Yucatán, México

Alejandro Rafael Suárez-Galaz1, Silvia F. Hernández-Betancourt2, Jesus Alonso Panti-May1, Pablo C. Manrique-Saide2, Marco Torres-Castro1*

1Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi”, Universidad Autónoma de Yucatán; 2Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán.

Historial del artículo

Recibido: 10 mar 2021

Aceptado: 27 ago 2021

Disponible en línea: 1 sep 2021

 

 

Palabras clave

Musarañas, infección, Leptospira spp., hospedero, insectívoro, Yucatán

Keywords

Shrews, infection, Leptospira spp., host, insectivore, Yucatan

Copyright © 2021 por autores y Revista Biomédica.

Este trabajo está licenciado bajo las atribuciones de la Creative Commons (CC BY).

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*Autor para correspondencia: Marco Antonio Torres-Castro, Laboratorio de Enfermedades Emergentes y Reemergentes, Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi”, Universidad Autónoma de Yucatán. Avenida Itzáes, No. 490 x Calle 59, Col. Centro, C.P. 97000. Mérida, México.

E-mail: antonio.torres@correo.uady.mx

http://revistabiomedica.mx

abstract

1.  

Evidence for Leptospira spp. in shrews Cryptotis mayensis. New host in Yucatan, Mexico.

Introduction. The pathogenic species of the Leptospira genus cause leptospirosis in susceptible humans and animals. Rodents are natural reservoirs of the bacteria; other wild animals are accidental hosts. Shrews have been involved in the transmission cycle of this pathogen in several countries; however, in Mexico, there is no information regarding this.

Objective. To describe the infection with Leptospira spp. in shrews captured in Yucatan, Mexico.

Material and methods. Two shrew specimens (Cryptotis mayensis) were captured in the municipality of Hunucma. Both were euthanized in order to collect samples from the kidney, spleen, and skeletal muscle for total DNA extraction. Leptospira spp. infection was screened by standard PCR for the amplification of a 16S ribosomal gene fragment (16S rRNA). Likewise, to verify and strengthen the results, other assays were carried out for the amplification of fragments corresponding to the lipL32 and rpoC genes.

Results. In the DNA extraction from kidney tissue from one specimen, amplifications of the 16S rRNA and rpoC genes were obtained.

Conclusion. This work represents the first report of Leptospira spp. infection in the renal tissue of C. mayensis from Yucatan, Mexico. More studies are needed in the region to determine the participation of these animals in the epidemiological cycle of this bacterial genus.

Resumen

Introducción. Las especies patógenas del género Leptospira ocasionan la leptospirosis en seres humanos y animales susceptibles. Los roedores son los reservorios naturales de estas bacterias; otros animales silvestres son hospederos accidentales. Las musarañas han sido involucradas en el ciclo de transmisión de este patógeno en varios países; sin embargo, en México, no existe información al respecto.

Objetivo. Describir la infección con Leptospira spp. en musarañas capturadas en Yucatán, México.

Material y métodos. Se capturaron dos ejemplares de musaraña (Cryptotis mayensis) en el municipio de Hunucmá. A ambos se les practicó la eutanasia para recolectar fragmentos de riñón, bazo y músculo esquelético que sirvieron para la extracción de ADN total. La infección con Leptospira spp. se exploró por PCR convencional para la amplificación de un fragmento del gen 16S ribosomal (16S rRNA). Asimismo, para corroborar y robustecer los resultados, se realizaron otras reacciones para la amplificación de fragmentos correspondientes a los genes lipL32 y rpoC.

Resultados. En la extracción de ADN correspondiente al tejido renal de un ejemplar se obtuvieron los amplificados de los genes 16S rRNA y rpoC.

Conclusión. Este trabajo representa el primer reporte de la infección con Leptospira spp. en tejido renal de C. mayensis de Yucatán, México. Es necesario realizar más estudios en la región para determinar la participación de estos animales en el ciclo epidemiológico del género bacteriano.

IIntroducción

Leptospira es un género bacteriano cuyas especies que pertenecen al subgrupo patógeno ocasionan la leptospirosis en seres humanos y animales susceptibles. Esta zoonosis tiene tasas variables de prevalencia e incidencia en los diferentes estados con regiones de climas tropicales y subtropicales de México, entre ellos Yucatán (1).

Los animales silvestres infectados pueden ser fuente importante de infección para los seres humanos y animales domésticos, sobre todo para aquellos que están en contacto cercano y permanente, a través de la excreción de orina con bacterias viables que sobreviven en las condiciones propicias medioambientales (2). En animales silvestres de Yucatán existen reportes de la exposición a la infección con este género bacteriano, entre ellos roedores Mus musculus, Rattus rattus y Heteromys gaumeri (3), murciélagos Artibeus jamaicensis, Pteronotus parnellii y Chiroderma villosum (4) y zarigüeyas Didelphis virginiana (5); sin embargo, las musarañas no han sido implicadas en el ciclo epidemiológico de Leptospira spp.

A nivel mundial, el conocimiento sobre la participación de las musarañas en el ciclo de transmisión, principalmente el que se presenta en ambientes silvestres, es insuficiente. No obstante, se ha especificado que estos animales pueden ser portadores accidentales de varias especies patógenas de leptospiras (6). El objetivo del presente estudio es describir la infección con Leptospira spp. en musarañas capturadas en Yucatán, México.

Material y métodos

Como parte de un proyecto enfocado en la identificación de virus hemorrágicos en pequeños mamíferos de la península de Yucatán, México, se realizaron capturas de murciélagos y roedores silvestres en distintas localidades. En enero de 2019 se capturaron con trampas Sherman (7.5 cm x 23 cm x 9 cm, HB Sherman Traps Inc®; Estados Unidos de América [EUA]) dos ejemplares de musaraña en Hunucmá, Yucatán (21°02’44.6’’ N, 89°50’19.1’’ W; 21°04’49.3’’ N, 89°53’01.1’’ W).

La extracción de los animales fue aprobada por la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT) de México (acta: SGPA/DGVS/05995/19). La eutanasia y la recolección de muestras biológicas fueron aprobadas por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad Autónoma de Yucatán (UADY) (acta: CB-CCBA-I-2018-001), Mérida, México.

Ambos individuos fueron trasladados a una estación de campo establecida en la localidad de captura para su anestesia y eutanasia con isoflurano y pentobarbital, respectivamente (7). Seguidamente, se realizó una necropsia para la recolección de fragmentos de riñón, bazo y músculo esquelético que fueron depositados en tubos estériles para microcentrífuga de 1.8 ml (Eppendorf®; Alemania) con alcohol al 96 %. Estos tejidos se usaron para la extracción de ADN total que se efectuó con el kit DNeasy® Blood & Tissue (QIAGEN®; Alemania), previa digestión con proteinasa K (Omega Bio-tek® Inc.; EUA). Las extracciones de AN total fueron evaluadas en un Nanodrop® (Thermo Scientific®; EUA) para conocer su concentración y pureza.

Las pieles y cráneos de los ejemplares se depositaron en la Colección de Mastozoología de la FMVZ, UADY con las claves de registro CM-1405 y CM-1408.

La identificación de Leptospira spp. se realizó por medio de PCR convencional, para lo cual primero se intentó la amplificación de un fragmento del gen 16S ribosomal (16S rRNA) y posteriormente, para confirmar y robustecer los resultados, con reacciones distintas se intentó la amplificación de fragmentos de los genes rpoC o lipL32. Todas estas reacciones fueron hechas por duplicado.

En la tabla se muestran las secuencias de oligonucleótidos, los tamaños de amplificados, volúmenes de los reactivos y las condiciones de amplificación para la detección de Leptospira spp. en los individuos estudiados. En todas las reacciones se utilizó como control positivo una extracción de ADN de Leptospira spp. tipificada como L. borgpetersenii y como control negativo una mezcla de todos los reactivos de la reacción correspondiente a excepción de la extracción de ADN. Todas las reacciones se realizaron en el termociclador Mastercycler Personal® (Eppendorf ®; Alemania).

La electroforesis de los productos de las reacciones se realizó en geles de poliacrilamida al 8 % y se visualizaron en una pantalla de luz blanca. Los resultados se registraron con fotografías.

Tabla. Reactivos y condiciones de amplificación empleadas para la detección de Leptospira spp. en los tejidos de Criptotis mayensis capturadas.

Gen	Oligonucleótidos (5’ 3’)	Tamaño del amplificado (pb)	Volumen de los reactivos*	Condiciones de amplificación	Referencia
16S rRNA	F; 16S4F: GAACGGGATTAGATACC R; 16S6R: CCTAGACATAAAGGCCATGA	440	2.5 µl PCR Buffer 1X 2.5 µl MgCl2 0.5 µl dNTP’s 0.5 µl de cada cebador 0.2 µl Taq ADN polimerasa** 13.30 µl agua ultra pura 5 µl ADN templado	Desnaturalización inicial 95° C, 5 min. 35 ciclos: 1) 95° C, 30 segundos; 2) 58° C, 30 segundos; 3) 72° C, 30 segundos. Elongación final 72° C, 5 min.	4
lipL32	F; lipL32/270F: GCTGAAATGGGAGTTCGTATGATT R; lipL32/692R: CCAACAGATGCAACGAAAGATCCTTT	423		Desnaturalización inicial 95° C, 5 min. 40 ciclos: 1) 95° C, 30 segundos; 2) 57° C, 15 segundos; 3) 72° C, 40 segundos. Elongación final a 72° C, 5 min.	8
rpoC	F; rpoCF: CAAGGGGTTCATATCAACGATAA-3´ R; rpoCR: GTTCCGGCAGGGATCATGTGACC-3	353	2.5 µl PCR Buffer 1X 2.5 µl MgCl2 0.5 µl dNTP’s 1.0 µl de cada cebador 0.15 µl Taq ADN polimerasa** 12.35 µl agua ultra pura 5 µl ADN templado	Desnaturalización inicial 94° C, 5 min. 35 ciclos: 1) 94° C, 35 segundos; 2) 58° C, 45 segundos; 3) 72° C, 1 min. Elongación final 72° C, 5 min.	9

pb: pares de bases.

F: forward (sentido); R: reverse (antisentido).

*25 ml de volumen final; ** Fermentas®; EUA.

Resultados

Se estudiaron dos ejemplares hembras de la especie Cryptotis mayensis. En uno se obtuvo el amplificado del gen 16S rRNA en una extracción de ADN correspondiente al tejido renal, resultado que se validó con el amplificado del gen rpoC que se exhibe en la figura. Este ejemplar era una hembra adulta activa, es decir, durante su procesamiento se observó que presentaba la vagina abierta y en la necropsia se identificaron cicatrices e irregularidades en el cuello uterino.

 

Figura. Gel de poliacrilamida al 8 % que muestra un amplificado de 353 pares de bases (pb) correspondiente al gen rpoC de Leptospira spp. Carril 1: marcador de peso molecular (100 pb); carril 2: control positivo; carriles 3,4: muestras negativas (hígado y músculo esquelético); carril 5: muestra positiva (riñón); carril 6: control negativo.

Discusión

Existen evidencias a nivel internacional, la mayor parte de ellas obtenidas con herramientas de diagnóstico molecular, de la intervención de varias especies de musarañas en el ciclo de transmisión de Leptospira spp. Algunos ejemplos son Mayer-Scholl et al (10) en Alemania, Nally et al (11) en Irlanda y Mgode et al (12) en Tanzania. A pesar de esto, hasta donde sabemos, este es el primer reporte de musarañas infectadas con Leptospira en México.

Han sido escasamente explorados los factores que generan la infección con Leptospira spp. en musarañas capturadas en ambientes silvestres o rurales. En este sentido, Mgode et al (12) señalan que estos animales suelen compartir el nicho ecológico con varias especies de roedores, lo cual es importante porque los roedores son los principales diseminadores de Leptospira spp. en el medioambiente (3). Particularmente, se ha descrito que C. mayensis convive con poblaciones de roedores silvestres como H. gaumeri, M. musculus, Oryzomys melanotis, Ototylomys phyllotis, Otonyctomys hatti y Peromyscus yucatanicus (13). En Yucatán, se ha descrito la infección con leptospiras patógenas en H. gaumeri, M. musculus y R. rattus (3), por lo que es factible que la interacción entre estas especies y el uso común de espacios contaminados con leptospiras excretadas por la orina de los roedores mencionados, generen la transmisión entre las poblaciones (14).

Aunque especulativo, otro factor que pudo influir en la infección con Leptospira spp. en una de las musarañas estudiadas, es el consumo de insectos con restos de sustrato (contaminado con bacterias viables) en sus extremidades. Este mecanismo de transmisión ha sido propuesto con otros animales insectívoros capturados en Yucatán (4).

Por otro lado, se ha informado que las musarañas son capaces de excretar leptospiras patógenas por la orina y contaminar el medioambiente (6), lo cual cobra relevancia por la identificación de ADN de Leptospira spp. en el tejido renal de un individuo estudiado y aunque aún no se ha establecido la conexión entre la circulación de musarañas infectadas y la presencia de casos de leptospirosis humana, Widiastuti et al (15) han sugerido esta probabilidad.

Una limitante de este trabajo, además del número reducido de individuos estudiados, es que no se determinó la especie infectante. En este contexto, es relevante indicar que la reacción molecular empleada (rpoC) para corroborar los resultados tiene un valor alto de sensibilidad, logrando detectar hasta 35 especies de Leptospira spp., entre ellas las patógenas e intermedias que ocasionan la leptospirosis (9).

Nuestro hallazgo, resalta la importancia de estudiar a los pequeños mamíferos o micromamíferos de Yucatán para determinar y/o disminuir el riesgo de transmisión de microorganismos zoonóticos a los seres humanos y animales domésticos susceptibles, sobre todo en las comunidades rurales (11).

Conclusión

Se presenta la primera identificación molecular de Leptospira spp. en tejido renal de una musaraña (C. mayensis) de Yucatán, lo cual establece que estos animales son hospederos del agente patógeno. Son necesarios más estudios para determinar las especies de leptospiras asociadas a estos mamíferos y para comprender mejor su participación en el ciclo epidemiológico de este género bacteriano.

Agradecimientos

A los estudiantes involucrados en la captura y procesamiento de los animales. El trabajo de campo fue financiado por el proyecto “Análisis y evaluación de los probables vectores y reservorios del virus del Ébola en México”, CONACYT-251053, apoyado por el Fondo Sectorial de Investigación para la Educación.

Referencias

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