Caracterización del proceso de metaciclogénesis in vitro de promastigotes de Leishmania (Leishmania) mexicana

Karla Fabiola Chacón-Vargas1; Gerardo Corral-Ruiz2; Luvia Enid Sánchez-Torres2*

1 Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Chihuahua, Circuito Universitario, s/n, 31125 Chihuahua, Chih., México. 2 Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, Prolongación de Carpio y Plan de Ayala, s/n, 11340 Ciudad de México, México.

Historial del artículo

Recibido: 30 ene 2022

Aceptado: 10 ago 2022

Disponible en línea: 1 ene 2023

 

 

Palabras clave

Leishmania mexicana, metaciclogénesis, curva de crecimiento

Keywords

Leishmania mexicana, metacyclogenesis, growth curve

Copyright © 2023 por autores y Revista Biomédica.

Este trabajo está licenciado bajo las atribuciones de la Creative Commons (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

 

*Autor para correspondencia: LE Sánchez-Torres, Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 11340 Ciudad de México, México. Móvil:5545389714

E-mail: luviasanchez@hotmail.com; lsanchezt@ipn.mx

https://revistabiomedica.mx.

abstract

1.  

Characterization of the in vitro metacyclogenesis process of Leishmania (Leishmania) mexicana promastigotes

Introduction. Leishmaniasis is a spectrum of vector-borne diseases caused by protozoa of the genus Leishmania sp. In Mexico, species of the Leishmania (L.) mexicana complex are endemic and cause cutaneous leishmaniasis. During the development of the parasite in the vector and in culture, the process of metacyclogenesis has been described, which consists of morphological and biochemical changes for the transformation of procyclic promastigotes into metacyclic promastigotes.

Objective. To characterize the process of metacyclogenesis in axenic cultures of Leishmania (L.) mexicana.

Materials and methods. In promastigote cultures of L. (L.) mexicana, different parameters were evaluated daily for 15 days to determine changes over time. Cellularity, morphology, and cell viability parameters were analyzed by optical microscopy and flow cytometry.

Results. In the growth curve, three stages were identified. a) Logarithmic phase, from day 0 to 6, procyclic promastigotes predominate, they are larger, viable, metabolically active and have a high replication rate; b) stationary phase, from day 7 to 10, metacyclic promastigotes are abundant, they are thin and elongated, there is a proportion of the parasites with loss of viability; c) death phase, from day 11, there is a decrease in cell density and the remaining parasites present apoptotic characteristics.

Conclusion. The characterization of the growth curve of L. (L.) mexicana allows to identify easily, quickly, and at low-cost, the time when there is a higher proportion of metacyclic promastigotes in culture, reducing the variability in the results of in vitro and in vivo experiments.

RESUMEN

Introducción. La leishmaniasis es un espectro de enfermedades transmitidas por vector causada por protozoarios del género Leishmania sp. En México, especies endémicas del complejo Leishmania (L.) mexicana son las causantes de leishmaniasis cutánea. Durante el desarrollo del parásito en el vector y en cultivo, se ha descrito el proceso de metaciclogénesis que consiste en cambios morfológicos y bioquímicos para la transformación de promastigotes procíclicos en promastigotes metacíclicos.

Objetivo. Caracterizar el proceso de metaciclogénesis en cultivos axénicos de Leishmania (L.) mexicana.

Materiales y métodos. En cultivos de promastigotes de L. (L.) mexicana se evaluaron diferentes parámetros diariamente y a la misma hora durante 15 días para conocer los cambios a través del tiempo. Se analizó la densidad celular, morfología y parámetros de viabilidad celular por microscopía óptica y citometría de flujo.

Resultados. Durante el seguimiento de la curva de crecimiento se identificaron 3 etapas; a) fase logarítmica, del día 0 al 6, predominan promastigotes procíclicos, poseen mayor tamaño, son viables, metabólicamente activos y con alta tasa de replicación; b) fase estacionaria, del día 7 al 10, predominan promastigotes metacíclicos, son delgados y alargados, una proporción de los parásitos presentan pérdida de viabilidad; c) fase de declive, a partir del día 11, hay disminución de la densidad celular y los parásitos restantes presentan características apoptóticas.

Conclusiones. La caracterización de la curva de crecimiento de L. mexicana permite identificar fácil, rápido y a bajo costo, cuando hay mayor proporción y calidad de promastigotes metacíclicos, reduciendo la variabilidad en los resultados de experimentos in vitro e in vivo.

INTRODUCCIÓN

La leishmaniasis es una parasitosis considerada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) dentro de las enfermedades tropicales desatendidas. Esta enfermedad tiene un gran impacto en la población mundial; en el continente americano, se encuentra presente en al menos 19 países y se registran de 700 mil a 1 millón de casos al año, lo cual corresponde a dos terceras partes del total; Brasil es el país más afectado (1,2). Desafortunadamente México no está exento de esta enfermedad, la mayoría de los casos se presentan en la región centro-sureste del país y son causadas principalmente por especies del complejo Leishmania (L.) mexicana; sin embargo, también se han reportado casos por especies del complejo L. (V.) braziliensis y la especie L. (L.) chagasi (3-6).

Este parásito es transmitido a humanos y a otros animales por vectores del género Phlebotomus en el Viejo Mundo o del género Lutzomyia en el Nuevo Mundo y abarca un espectro de enfermedades que pueden englobarse en tres diferentes grupos de manifestaciones clínicas. La leishmaniasis cutánea (LC) con la aparición de úlceras cutáneas que pueden llegar a curarse por sí mismas o que pueden evolucionar a una leishmaniasis mucocutánea (LMC) caracterizada por una infección invasiva que ocasiona la destrucción de la mucosa nasofaríngea, y por último la leishmaniasis visceral (LV) con una elevada tasa de mortalidad y que es causada por la diseminación del parásito afectando principalmente al bazo e hígado (7,8). El patrón de desarrollo de la manifestación clínica es dependiente de la especie de Leishmania involucrada, así como del sistema inmunológico del hospedero pudiendo tener consecuencias importantes como la mutilación, discapacidad e incluso la muerte (7). En México, la LC es la que se presenta en la mayoría de los casos (3).

Leishmania spp. presenta dos diferentes estadios básicos durante su ciclo de vida. El promastigote localizado extracelularmente en el hospedero invertebrado, mientras que el segundo corresponde a la fase intracelular o amastigote, los cuales se encuentran infectando diferentes células del sistema inmunológico dentro del hospedero vertebrado. El promastigote se multiplica en el tracto digestivo del vector, para posteriormente ser transmitido al mamífero a través de la regurgitación del vector durante su alimentación (9). Morfológicamente se caracteriza por ser fusiforme de 12 a 20 µm de largo, con un núcleo central y un flagelo anteronuclear que nace del cuerpo basal situado por delante del cinetoplasto (10). Tras el depósito de los promastigotes en la dermis del mamífero, éstos son fagocitados por diferentes células inmunológicas como los neutrófilos, macrófagos o células dendríticas. Durante este proceso ocurre la formación del fagolisosoma, sin embargo, el parásito es capaz de evadir su destrucción en esta estructura celular; así, luego de pasar por una serie de cambios morfológicos, los promastigotes se convierten en amastigotes, los cuales se multiplican por fisión binaria (11). Esta fase del parásito tiene forma esférica con un diámetro de 2.5 a 3.5 µm, con el flagelo internalizado, tiene un núcleo excéntrico y un cinetoplasto que consta de un blefaroplasto y cuerpo basal, de donde nace un rizoplasto que se convierte en el flagelo del promastigote (10).

En el tracto digestivo del vector, se han descrito diferentes formas del parásito que implican cambios morfológicos y bioquímicos, a este proceso se le conoce como metaciclogénesis. Estas modificaciones favorecen la transformación de los promastigotes no infectivos (procíclicos) en promastigotes infectivos (metacíclicos) permitiéndoles sobrevivir a las adecuaciones del microambiente tras localizarse en el hospedero mamífero; este proceso también se ha demostrado en cultivos axénicos. Morfológicamente los promastigotes procíclicos son alargados y con un flagelo más corto que los promastigotes metacíclicos, los cuales son de menor tamaño y más delgados; los primeros se multiplican de manera logarítmica, mientras que los segundo no son replicativos. Este proceso de metaciclogénesis es vital en el parásito ya que le permite adquirir la capacidad infectiva (12-15), de ahí la importancia de poder identificar esta fase en los cultivos axénicos y poder utilizarlos de manera estandarizada en estudios de infección in vitro e in vivo, que permitan entre otras cosas, estudiar la respuesta inmune del hospedador, los mecanismos de evasión del parásito y la evaluación de posibles fármacos contra esta enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de la cepa de Leishmania (L.) mexicana

Se utilizaron promastigotes de L. (L.) mexicana (ATCC MNYC-BZ/62/M379) mantenidos en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB, Gibco) inactivado y 1% de penicilina/estreptomicina (100 U/mL, In vitro S. A.). Los cultivos se incubaron a 27°C en oscuridad.

Curva de crecimiento de promastigotes de L. (L.) mexicana

A partir de un cultivo de promastigotes de L. (L.) mexicana en fase estacionaria se realizó la resiembra de 0.2x106 parásitos/mL en medio RPMI suplementado. El día de la resiembra se consideró como día cero. A partir del día 1 y hasta el día 15, se realizaron conteos diarios, siempre a la misma hora, utilizando una cámara de Neubauer.

Análisis morfológico

Cada 24 horas se tomó una alícuota del cultivo, los parásitos fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) y colocados en un portaobjetos utilizando una citocentrífuga (LaboFuge 400, Thermo Scientific) a 3000 rpm durante 3 min; una vez secas, las muestras se fijaron con metanol y se tiñeron con Giemsa 1:10 durante 30 min. Los frotis se observaron en un microscopio óptico (Primo Star, Carl Zeiss) a 100x y se capturaron imágenes representativas con una cámara AxioCam ERc 5s, las cuales fueron analizadas en el software ZEN 2011(16).

Caracterización de la curva de crecimiento por citometría de flujo

Diariamente se tomaron muestras de los promastigotes y se evaluaron las modificaciones que el parásito presentó a través del tiempo en tamaño y complejidad interna, potencial de membrana mitocondrial e integridad de la membrana plasmática haciendo uso de la citometría de flujo. La adquisición de las muestras se llevó a cabo en el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA), se registraron 10,0000 eventos de cada muestra y se analizaron en el software CellQuest Pro versión 6.1 (Becton Dickinson).

a) Cambios en tamaño y complejidad interna

Una vez lavados y resuspendidos en PBS, los parásitos se adquirieron en el citómetro de flujo. Los cambios morfológicos fueron analizados en una gráfica de puntos (dot-plot) de tamaño contra complejidad interna, donde se registraron los patrones de dispersión de la luz frontal (FSC, para tamaño) y lateral (SSC, complejidad) generados por los parásitos (16).

b) Potencial de membrana mitocondrial (ψm) e integridad de membrana plasmática

Los promastigotes se tiñeron con 20 µL de Rhodamina 123 (Rho123, 10 µg/mL; Sigma), se incubaron durante 30 min en oscuridad a temperatura ambiente. Se realizaron dos lavados con PBS y se resuspendieron en 300µL del mismo buffer. Posteriormente, se adicionaron 10 µL de yoduro de propidio (PI, 20µg/mL; Sigma), y se dejaron incubar a temperatura ambiente y protegidos de la luz durante 10 min. Las muestran fueron adquiridas en el citómetro de flujo; la integridad de membrana plasmática (exclusión del PI) y el potencial de membrana mitocondrial (retención de la Rho 123) fueron analizadas por separado y simultáneamente mediante un análisis monoparamétrico y un análisis biparamétrico respectivamente (16).

RESULTADOS

Curva de crecimiento de L. (L.) mexicana

En la figura 1 se muestra la curva de crecimiento obtenida al comparar la concentración celular con respecto a los días de cultivo. En la curva se identificaron tres fases importantes: a) fase logarítmica o de crecimiento exponencial, la cual se presenta desde el inicio del cultivo hasta el sexto día; durante esta etapa la densidad celular se incrementó con respecto al tiempo de cultivo; b) fase estacionaria, que va del séptimo al décimo día y en la cual, el número de parásitos prácticamente no se modificó y c) fase de declive, que inicia a partir del onceavo día, y en la que hay una disminución paulatina del número de parásitos.

 

Figura 1. Curva de crecimiento in vitro de promastigotes de Leishmania (L.) mexicana. A partir de un inóculo inicial de 0.2 x106 promastigotes/mL, se realizaron conteos diarios de promastigotes viables durante 15 días en cámara de Neubauer. a) Fase logarítmica, b) fase estacionaria, c) fase descendente/declive. Los resultados graficados representan el promedio ± ds de tres experimentos independientes.

Caracterización de la curva de crecimiento de promastigotes L. (L.) mexicana

Se realizaron análisis morfológicos, de función mitocondrial, así como de integridad de membrana celular de los promastigotes de L. (L.) mexicana. En la tabla 1, se muestra una imagen representativa de cada uno de los parámetros evaluados durante los diferentes días de incubación y que se describen a continuación.

En el análisis morfológico (tabla 1, columna a) se observó que del primero al sexto día de cultivo predominaron los parásitos anchos, con el extremo posterior redondeado y con un flagelo relativamente corto. En la fase estacionaria (días 7-10), la morfología de los parásitos fue más uniforme, tienen forma alargada, son afilados y el flagelo es más largo que el cuerpo de parásito. A partir del décimo día y más claramente a partir del onceavo día, se observó la presencia de células redondeadas, que adquirieron una tinción más tenue y sus organelos estaban menos definidos. En los días 13 y 14 de cultivo, fue evidente la disminución de la densidad celular que correlaciona con los datos de la figura 1, y los pocos parásitos que se aprecian, muestran una estructura celular dañada. Estas observaciones correlacionan con el análisis citométrico presentado (tabla 1, columna b) que muestra los cambios en el tamaño (FSC) y complejidad interna (SSC) de los parásitos durante los 14 días de seguimiento. En el primer día de cultivo, la mayor parte de los promastigotes se detectan como células grandes (FSChigh; identificados con ) y con una complejidad interna intermedia. A partir del segundo día y hasta el final del cultivo, la población celular se desplazó de manera paulatina a un valor menor en la escala de FSC que implica una reducción del tamaño celular (FSCmed, marcada con). Del segundo día y hasta el quinto día, se aprecia un núcleo poblacional celular principal, el cual corresponde a promastigotes en la fase logarítmica. En el séptimo día se aprecia una subpoblación aún de menor tamaño en el vértice de la gráfica que fue aumentando progresivamente (FSClow, señalada con ), este periodo corresponde a la fase estacionaria en la que se mencionó previamente, que no hubo cambios importantes en la densidad celular, pero sí en la morfología de los promastigotes. En la etapa de declive, la cantidad de promastigotes con un tamaño muy pequeño se incrementó de manera progresiva hasta convertirse en la población mayoritaria en la etapa final de la curva de crecimiento.

El potencial de membrana mitocondrial (tabla 1, columna c) es un parámetro que nos permite evaluar de manera general el funcionamiento celular. En los primeros días de cultivo (del día 1 al 4), la mayoría de los promastigotes presentaron un potencial de membrana mitocondrial alto (Rho123high , identificados con ), sin embargo, este porcentaje disminuyó conforme avanzó el tiempo; a partir del quinto día de cultivo, se apreció una población de parásitos que da una señal de fluorescencia a la izquierda contigua de la población principal (Rho123med, marcados con), la cual representa a promastigotes con un potencial de membrana mitocondrial menor a lo normal. Como se observa en la columna c, es a partir del día siete cuando el nivel de tinción con Rho123 indica que un porcentaje creciente de los parásitos del cultivo presentan una pérdida total del potencial de membrana mitocondrial (Rho123low, señalados con ), evento directamente relacionado con la activación de un mecanismo de muerte irreversible en los parásitos; dicha proporción es más alta en la fase de declive (a partir del día 11 de cultivo) y concuerda con al análisis morfológico descrito anteriormente en el que se señaló una disminución en el tamaño de las leishmanias (tabla 1, columna a) y con la baja densidad celular presente. De manera paralela, se evaluó la integridad de la membrana plasmática de los promastigotes durante la curva de crecimiento (tabla 1, columna d), lo cual permitió cuantificar el porcentaje de promastigotes con potencial de membrana mitocondrial normal y membrana celular íntegra (cuadrante inferior derecho de los diagramas de puntos, señalado con ) a lo largo del cultivo, ambos son parámetros presentes en parásitos viables. Al cuantificar estos dos eventos, se observó que a partir del día 6 de cultivo, el porcentaje de promastigotes que han perdido potencial de membrana mitocondrial aumenta conforme avanzan los días, y que esto va de la mano con la disminución del porcentaje de parásitos viables (figura 2).

 

Figura 2. Porcentaje de promastigotes de Leishmania (L.) mexicana viables o con pérdida de potencial de membrana mitocondrial (ψm) durante el seguimiento de la curva de crecimiento. El porcentaje de promastigotes con pérdida de ψm corresponde a la población de promastigotes Rho 123 negativos. El porcentaje de parásitos viables se cuantificó considerando los promastigotes Rho 123 positivos y PI negativos. Se grafica el promedio del porcentaje de promastigotes para cada caso ± ds de tres experimentos independientes.

Tabla 1. Caracterización de la curva de crecimiento de promastigotes de L. (L.) mexicana. Diariamente se tomó una muestra de cada cultivo para determinar la densidad celular y caracterizar diversos parámetros: a) morfología celular (la barra equivale a 20 µm); b) modificaciones en tamaño y complejidad interna (FSC vs SSC); c) el potencial de membrana mitocondrial (ψm, tinción con Rho 123); d) potencial de membrana mitocondrial e integridad de membrana plasmática (Rho 123 vs PI). Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes

 

El análisis de los datos en conjunto indica que, en la fase logarítmica, la mayor parte de los promastigotes tienen un mayor tamaño, están viables, metabólicamente activos y con alta tasa de replicación. En la fase estacionaria aparecen formas más delgadas y alargadas con menor volumen, la mayoría exhiben membrana plasmática íntegra y una proporción de los parásitos presentan pérdida del potencial de membrana mitocondrial; el análisis biparamétrico (Rho 123 vs PI) muestra que esta población tiene características de promastigotes apoptóticos, por lo tanto, en esta fase hay una mezcla de promastigotes viables y en proceso de muerte apoptótica. En la etapa final o de declive de la curva de crecimiento, hay disminución en la densidad celular debido a la muerte de los parásitos, y la mayor parte de la población que queda aún en los cultivos, presenta características de parásitos apoptóticos.

DISCUSIÓN

En 1989, Sacks realiza los primeros reportes que evidencian el proceso de metaciclogénesis en Leishmnia sp. tanto en el vector como en cultivo in vitro, y menciona que los promastigotes presentan una serie de cambios secuenciales para pasar de un estado no infectivo a uno infectivo (17). Por otro lado, los primeros reportes con L. mexicana surgen en 1993 por Bates y colaboradores, al replicar el ciclo de vida de esta especie in vitro, describiendo esta secuencia de cambios morfológicos y bioquímicos al modificar las condiciones de pH y temperatura del cultivo favoreciendo la transformación del parásito a promastigotes (18,19).

Se ha definido que las formas procíclicas son más grandes, con un flagelo corto y una alta tasa de multiplicación, en cambio los parásitos metacíclicos son más pequeños y delgados, con un flagelo largo; en algunas especies como L. braziliensis el largo del flagelo es dos veces el largo del cuerpo del parásito (18, 20, 21). Además, están involucrados una serie de moléculas de superficie que son determinantes para conferir la capacidad infectiva a los promastigotes metacíclicos; dos de las más estudiadas son la lipofosfoglicana (LPG) y la glicoproteína gp63, que recubren al promastigote metacíclico. Estas son clave en la evasión de la respuesta inmunológica al conferirle resistencia a la lisis mediada por complemento y a la destrucción por el fagolisosoma en el interior del macrófago (22). Esta capacidad infectiva en los promastigotes metacíclicos también ha sido demostrada en L. major de manera in vitro con macrófagos peritoneales e in vivo (23).

De acuerdo a los resultados obtenidos observamos que en el cultivo de promastigotes de L. (L.) mexicana realizado en las condiciones descritas, la fase logarítmica (días 0-6) corresponde a la presencia de promastigotes procíclicos; la fase estacionaria (días 7-10) a promastigotes metacíclicos, y a partir del onceavo día inicia la fase de declive con un porcentaje alto de parásitos con disminuida viabilidad. La identificación del inicio y duración de la fase estacionaria es de vital importancia para establecer protocolos estandarizados que permitan utilizar de manera sistematizada parásitos en la misma fase para estudios in vitro e in vivo, como aquellos enfocados al estudio de los mecanismos de infección, de respuesta inmune, de evasión, así como para la evaluación de la actividad leishmanicida de diferentes moléculas sobre esta fase infectiva, así mismo, se puede realizar la determinación de la capacidad que tiene esta etapa para infectar macrófagos analizando su posterior conversión a amastigotes o al realizar la infección en ratones.

Las diferencias morfológicas observadas en este trabajo entre promastigotes procíclicos y metacíclicos, se vieron reflejados en los distintos patrones de dispersión de la luz mostrados en el análisis por citometría de flujo; los promastigotes metacíclicos al ser de menor volumen con respecto a los procíclicos, la dispersión de la luz frontal es baja, en cambio las formas procíclicas muestran una alta dispersión frontal de la luz. De acuerdo a lo anterior se puede identificar y cuantificar la población de promastigotes metacíclios dentro de una población total de promastigotes sin necesidad de purificar o realizar una tinción fluorescente, lo cual reduce tiempo y costos (24), favoreciendo la homogeneidad en la fase de los promastigotes que se usan en experimentos posteriores tanto in vitro como in vivo y reduciendo la variabilidad de los resultados.

Por otra parte, también es importante tener en cuenta que las células vivas generan un patrón de dispersión de la luz diferente a las células muertas, donde estas últimas al ser de menor tamaño debido al encogimiento o lisis celular, tienen un valor de dispersión frontal menor con respecto a las células vivas (25). Al realizar un seguimiento de los promastigotes durante el cultivo, es importante tener en cuenta la viabilidad celular para poder definir que las poblaciones pequeñas (FSCmed-low) en realidad corresponden a promastigotes metacíclicos viables y no a parásitos muertos o restos celulares; para esto se incluyó en la tinción con yoduro de propidio (PI) que permite hacer esta distinción (26).

Durante la metaciclogénesis, es importante además caracterizar las modificaciones que pueden ocurrir en diferentes organelos como las mitocondrias y que son de vital importancia para el parásito al proveerle de energía. En el caso de los tripanosomátidos, éstos se caracterizan por tener una sola mitocondria de gran tamaño (mitocondrión) (27). Al ser la citometría de flujo una herramienta multiparamétrica, se pueden evaluar varios parámetros simultáneamente, por lo cual durante el seguimiento de la curva de crecimiento además de evaluar los cambios en la morfología y la viabilidad, se evaluó la pérdida de potencial de membrana mitocondrial con el fluorocromo lipofílico catiónico Rho 123. Las células viables poseen un alto potencial de membrana mitocondrial y tienen la capacidad de retener el fluorocromo en el interior de la mitocondria reflejando una alta fluorescencia. En las células en etapas tempranas de apoptosis el potencial de membrana mitocondrial decae, por lo cual disminuye la capacidad de retención del fluorocromo, mientras que en las células apoptóticas tardías e incluso en las necróticas la actividad mitocondrial es nula. Con base en lo anterior, el análisis simultáneo de viabilidad y pérdida de potencial de membrana mitocondrial (Rho 123 vs PI) permite la distinción entre células viables, apoptótica y apoptóticas tardías y/o necróticas. Es importante resaltar que los procesos de muerte celular programada como la apoptosis, ya ha sido demostrado que también ocurren en organismos unicelulares como Leishmania sp. y no es un proceso exclusivo de organismo pluricelulares (28).

La pérdida de potencial de membrana mitocondrial se ha relacionado con apoptosis en eucariontes, sin embargo se conoce muy poco del impacto en protozoarios (29). Lee y colaboradores, llevaron a cabo la evaluación de una serie de marcadores de muerte celular en un cultivo de promastigotes de L. donovani a diferentes días de incubación; en la fase estacionaria detectaron fragmentación del ADN con patrón de escalera y pérdida de potencial de membrana mitocondrial, concluyendo que en L. donovani se presenta un proceso de muerte celular programada cuando las células entran en fase estacionaria del cultivo (30), siendo esto congruente con nuestros resultados para L. mexicana.

Por otra parte es importante señalar que los promastigotes metacíclicos presentan parámetros bioquímicos característicos de células apoptóticas, lo que explica, al menos en parte, su alta capacidad de infectividad; diversas investigaciones se han centrado en que la muerte celular por apoptosis en Leishmania sp. es un mecanismo “altruista” de algunos promastigotes al momento de infectar a un mamífero para promover la sobrevivencia del resto de la población como amastigotes, debido a que la apoptosis, al ser un proceso de muerte que no emite señales de alerta, no favorece la activación del sistema inmunológico (14,31,32). Este proceso ha sido catalogado como una estrategia inmunomoduladora que le resulta esencial para el establecimiento de la infección y garantizar la superviviencia del parásito en el mamífero (33).

CONCLUSIÓN

La caracterización de la curva de crecimiento de L. (L.) mexicana analizando su densidad celular, los cambios morfológicos y parámetros de viabilidad celular por citometría de flujo permite identificar de manera fácil, rápida y a bajo costo, el momento en el que la mayor proporción de parásitos en un cultivo axénico presenta la fase de promastigotes metacíclicos, lo cual es importante para la realización de estudios in vitro e in vivo, reduciendo así la variabilidad en los resultados ocasionados por la presencia de diversas proporciones de promastigotes procíclicos/metacíclicos en cada experimento. Es importante resaltar que este análisis es particular de cada especie, por lo que es necesario realizarlo para aquella con la que se desee trabajar.

AGRADECIMIENTOS

KFCV cuenta con beca posdoctoral otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT, 252867), GCR cuenta con beca doctoral otorgada por CONACyT, (858657) y por el programa BEIFI-IPN (proyecto 20210048). LEST es becaria de la Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas–IPN (COFAA-IPN) y del programa de Estímulo al Desempeño de los Investigadores–IPN (EDI-IPN).

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran que no tiene ningún conflicto de intereses

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